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伊莎贝拉于1451年4月22日出生在马德里加尔·德·拉斯·阿尔塔斯·托雷斯(Madrigal de las Altas Torres)。
父亲是卡斯蒂利亚国王约翰二世(King John II of Castile),母亲是他的第二任妻子葡萄牙的伊莎贝拉(Isabella of Portugal)。
在伊莎贝拉出生时,她是王位的第二继承人,仅次于她的异母兄弟亨利。
当时亨利26岁,已婚但没有子嗣。
伊莎贝拉的弟弟阿方索在1453年11月17日出生,使她的继承位置降为第三位。
1454年,父亲去世后,亨利作为亨利四世登上王位。
伊莎贝拉和阿方索在亨利的照顾下生活。
随后,伊莎贝拉、母亲和阿方索搬到了阿雷瓦洛(Arévalo)。
这些年对伊莎贝拉来说是动荡的。