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一五○四年拉斐尔搬到佛罗伦萨，以便欣赏米开朗琪罗和达·芬奇的湿壁画竞技。他们两人的宏大草图在新圣母玛利亚教堂一起展出时，拉斐尔和佛罗伦萨每个上进心切的艺术家一样，将两幅草图都依样画了下来。但当时，达·芬奇似乎比米开朗琪罗启发他更多，且他研究达·芬奇风格之仔细，比几年前他研究佩鲁吉诺的风格更甚。他所受的影响显然不仅来自《昂加利之役》，因为达·芬奇其他素描、画作的主题，很快也出现在他自己的作品里。达·芬奇的《圣母子与圣安娜》（<i>Virgin and Child with Saint Anne</i>）草图（一五○一年在佛罗伦萨首度公开展出），教他将人物以金字塔状布置，以此平衡构图，让成群人物显得紧凑且井然有序。拉斐尔在佛罗伦萨期间所画的许多幅圣母子画作均竭尽所能探索此一构图的不同布局，因而有艺评家称它们是“根据达·芬奇某一主题所做的种种变化”。[13]
同样，从大概绘于一五○四年左右的《蒙娜丽莎》（<i>Mona Lisa</i>）上，拉斐尔找到了肖像画的姿势典范，这体现在他所绘的一些佛罗伦萨人物肖像画上。肖像画通常以侧面像呈现画中人，此一手法有可能仿自古代奖章、钱币上的侧面人像。但达·芬奇笔下的乔康达夫人，脸几乎正对观者，双手交叠，背景处诡异的风景以空气透视法呈现。这种姿势的出现其实是一大创新，但因为后来在人像上屡见不鲜，致使今人不识其深远意义。拉斐尔于一五○六年替马达莲娜·斯特罗齐绘制肖像时，几乎全盘照用这种姿势。
约与《蒙娜丽莎》同时，达·芬奇在佛罗伦萨完成了另一件杰作，即遗失已久的《勒达与天鹅》（<i>Leda and the Swan</i>）。这件作品完成后立即被送往法国，一百五十年后被付之一炬，下令烧毁者据推测是路易十四的第二任妻子曼特侬夫人。这位令人敬畏的夫人，以多种倒行逆施的措施（包括大斋节期间禁止歌剧演出），改革凡尔赛宫廷的道德风气。达·芬奇的这件作品因被她认为有伤风化，而遭此噩运。不管是否有伤风化，这件今人只能通过仿作了解的作品是达·芬奇少有的裸像作品之一。裸身的勒达采取对应姿势，双手放在使劲高举的天鹅脖子上。
达·芬奇虽然很提防后辈艺术家，特别是米开朗琪罗，却似乎允许拉斐尔阅览他的一些素描，原因可能在于这位年轻艺术家与他的好友布拉曼特有交情。[14]无论如何，拉斐尔见到了达·芬奇为《勒达与天鹅》所绘的草图，并素描了下来，后来根据此作品，确立了署名室中夏娃的姿势。拉斐尔的夏娃其实并不是原样照搬达·芬奇的勒达，而是如镜中影像般左右对调其局部后呈现，这是艺术家为免遭人识破抄袭而常用的手法。
署名室顶棚上四幅矩形画的最后一幅，《阿波罗与玛尔叙阿斯》（<i>Apollo and Marsyas</i>），大部分艺术史家同意系出自索多玛而非拉斐尔之手。这幅画以音乐竞技为主题，对一五○八年至一五○九年冬的罗马而言是很贴切的题材，对索多玛而言，事实证明也是很适合发挥的题材。
玛尔叙阿斯与阿波罗较量音乐的故事，历来被包括希罗多德、奥维德等多人谈过。这场竞赛实力悬殊，一方胜算不大，一方拥有无上权力。阿波罗是大神，掌管包括音乐、射术、预言、医学在内的众多事物；玛尔叙阿斯属于西勒诺斯（级别较低的森林之神），即长相丑陋、类似萨梯（森林之神）的动物种族，在艺术家笔下，常被画成长着驴耳朵的样子。
根据神话，玛尔叙阿斯拣到阿西娜发明的笛子。话说阿西娜为模仿蛇发女怪美杜莎遇害后另两名蛇发女怪发出的凄切恸哭声，制作了这支笛子。它的确逼真再现了这悲伤的声音，但这位爱慕虚荣的女神用它来吹奏曲子时，从水中倒影发现自己长相变丑，愤而将它丢掉。玛尔叙阿斯有了笛子后很快就成为吹笛高手，于是自信满满地向阿波罗叫战，要以笛子挑战他的弦乐器里拉。玛尔叙阿斯此举实在鲁莽，因为阿波罗曾以大胆向他挑战射箭为由，杀了自己的孙子欧律托斯。阿波罗同意应战，但附加了可怕的条件，谁输了就任由对方处置。
结果一如预期。在众缪斯神作为裁判下，阿波罗和玛尔叙阿斯使出浑身解数，一时分不出高下，但阿波罗巧妙倒转里拉，继续弹奏，无法如法炮制的玛尔叙阿斯立即技穷。获胜的阿波罗随后行使他赢得的权利，将玛尔叙阿斯吊在松树上，活活剥皮致死。林中动物为他的惨死而号哭，泪水化作米安德河支流玛尔叙阿斯河。笛子随河水漂流而下，最后被一个牧童从水中拾起。牧童颇识时务，将笛子献给也掌管牛羊的阿波罗。玛尔叙阿斯的皮则成为博物馆展示品，据说古时候放在位于土耳其境内的凯莱奈展出。
